溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以结肠黏膜弥漫性炎性损害为主要病理特征的消化系统疾病，是一种多因素、病因不清的慢性非特异性炎症性肠道疾病[1]。患者常出现腹痛、腹泻、血便等临床症状，个别患者有时出现贫血或急剧疼痛，发病年龄为20～50岁。国内外流行病学调查结果显示，UC发病率和死亡率均呈明显上升趋势，严重威胁人们的生命健康，已被WHO列为现代难治病之一。至今为止，UC的病因和发病机制尚未明确，尽管对其治疗做了很多研究，但仍未取得满意疗效和突破性进展[2]。大量研究证实，菌群与UC关系密切，肠道菌群失调被认为是UC发生的重要原因之一[3]；实验研究和临床研究均证明肠道益生菌可改善UC患者菌群失调和自身免疫功能，从而缓解或消除肠道炎症[4-5]。本研究通过检测活动期UC(active ulcerative colitis，AUC)和缓解期UC(remissive ulcerative colitis，RUC)患者粪便菌群，观察其微生态学改变及双歧杆菌对UC的治疗作用，探讨UC发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年5月—2013年3月在井冈山大学附属医院门诊就诊或住院的AUC患者64例(AUC组)和RUC患者71例(RUC组)，病程3个月～20年；另选取同期在本院体检健康者30例(对照组)，半年内均未服用过抗生素。AUC组中男33例、女31例，年龄21～57岁；RUC组中男38例、女33例，年龄20～59岁；对照组中男15例、女15例，年龄21～55岁。UC的诊断符合2007年中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组颁布的“对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见”中的诊断标准。患者或其监护人、对照者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、肠球菌、柱状真杆菌和普拉梭菌16SrDNA基因序列[6]，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计PCR引物。引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，各引物序列见表1。

肠道菌群上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)退火温度(℃)长度(bp)双歧杆菌CTCCTGGAAACGGGTGGTGCTGCCTCCCGTAGGAGT乳酸杆菌AGCAGTAGGGAATCTTCCACACCGCTACACATGGAG大肠埃希菌CATGCCGCGTGTATGAAGAACGGGTAACGTCAATGAGCAAA5276拟杆菌GGTTCTGAGAGGAGGTCCCGCTGCCTCCCGTAGGAGT5558普雷沃氏菌CAGCAGCCGCGGTAATAGGCATCCATCGTTTACCGT球形梭菌ACTCCTACGGGAGGCAGCGCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT柔嫩梭菌GTTGACAAAACGGAGGAAGGGACGGGCGGTGTGTACAA肠球菌CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATACTCGTTGTACTTCCCATTGT柱状真杆菌ACTCCTACGGGAGGCAGCCATTGCTCGTTCAGGGTTC5384普拉梭菌CAGCAGCCGCGGTAAACTACCTCTGCACTACTCAAGAAA通用引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTATTACCGCGGCTGCTGGC

1.2.2 肠道菌群培养 称取所有受试者新鲜粪便，按1∶10比例加入磷酸盐缓冲液(PBS)进行稀释，震荡后充分混匀，需氧菌稀释度为107～108，厌氧菌稀释度为108～109。采用不同的选择性培养基进行培养，每个平板均匀涂布50 μl稀释液，每种菌群涂布3个平板。双歧杆菌采用BBL琼脂，乳酸杆菌采用Lbs琼脂，大肠埃希菌和普雷沃氏菌采用伊红美蓝琼脂，拟杆菌采用胆汁-七叶甙(BBE)琼脂，球形梭菌、柔嫩梭菌和普拉梭菌采用哥伦比亚琼脂，肠球菌采用叠氮钠-结晶紫七叶苷琼脂，柱状真杆菌采用ES琼脂。需氧菌培养18～24 h，厌氧菌培养48～72 h，计算同一稀释度下平均菌落数，以lg n/g表示。

1.2.3 粪便细菌DNA提取 参照《分子克隆操作指南》和文献[7]介绍的方法加以改良：收集所有受试者粪便标本，取1 g粪便加0.01 M的PBS 9 ml，充分颠倒混匀后以1 000 r/min低速离心5 min，离心半径为10 cm，取上清液，上述过程重复3次，收集上清液以14 000 r/min高速离心10 min后取沉淀，离心半径为10 cm，反复用PBS洗涤3次，水洗1次，沉淀即为粪便总细菌。按细菌基因组DNA快速提取试剂盒的操作说明提取总细菌DNA并检测其浓度，-20 ℃冰箱保存备用。标准菌株37 ℃摇床200 r/min培养过夜，离心半径为10 cm，次日收集菌体并按细菌基因组DNA快速提取试剂盒的操作说明提取细菌DNA。

1.2.4 常规PCR与荧光定量PCR 采用长双歧杆菌CICC6068、嗜酸乳杆菌CICC6088、大肠埃希菌ACCC、粪肠球菌ACCC、拟杆菌CICC、普雷沃氏菌ATCC、柔嫩梭菌ATCC、普拉梭菌ATCC、柱状真杆菌ATCC、球形梭菌ATCC标准菌株进行常规PCR扩增。50 μl反应体系为：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，模板5 μl，上、下游引物各1 μl，石蜡20 μl，补充灭菌超纯水至50 μl。扩增参数：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、退火(温度见表1)30 s、72 ℃延伸30 s(共30个循环)，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳。

将上述标准菌株扩增产物回收、纯化，作为制作荧光定量PCR标准曲线的标准品。标准品和待测样品DNA进行16SrDNA荧光定量PCR反应。25 μl反应体系为：2×SYBR?Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，50×ROX Reference DyeⅡ 1 μl，DNA模板2 μl，补充灭菌超纯水至25 μl。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、退火(温度见表1)34 s、72 ℃延伸30 s(共40个循环)72 ℃延伸10 min，95 ℃变性15 s、退火(温度见表1)1 min、72 ℃延伸30 s，循环1次得到溶解曲线。